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氢气抗衰老,从美拉德反应谈起

  糖尿病是一种常见的代谢性疾病,主要表现为机体胰岛素相对或者绝对不足,导致血糖水平持续性增高。目前全球2型糖尿病患者已超过1.5亿人,而且预计在未来20年内病例数还将成倍数增长态势,全球医疗负担也会因为这一数值的显著提高而明显增加。
 

  不论是1型还是2型糖尿病,随着长期高血糖水平病程的逐渐进展,均可以造成不同程度的,不同靶器官的并发症,其中以心血管病变最为常见,也最具威胁性。血管并发症是导致糖尿病患者死亡的主要原因。其中,高血压,肥胖症,动脉粥样硬化,血脂代谢异常,糖尿病肾病亦是患者预后不良的重要危险因素。在糖尿病的发生发展过程当中,血管内皮的损伤和内皮功能障碍是糖尿病重要的早期病理表现。从细胞层面来讲,内皮细胞代谢异常则是早期内皮功能受损的基本原因,伴随着内皮细胞的不断凋亡和功能受损,随之而来的则是内皮功能障碍。
 

  晚期糖基化终末产物是以体内大分子物质如脂肪,蛋白质,核酸和还原性糖(葡萄糖,果糖,戊糖)为原料,在生理环境中通过发生非酶促反应,生成的稳定共价键产物。
 

  氢思:生物分子被还原性单糖还原,有人可能会觉得这种还原反应可能会导致生物分子发生还原改变,这不是分子层面的典型还原损伤?其实在生物系统,被氧化是生物大分子的主流,即使这些分子因为被还原导致了分子修饰或损伤,也必然会走向被氧化的结局。
 

  这种非酶促反应称之为---Maillard(美拉德反应)。1953年Hodge等学者提出了美拉德反应,该反应主要包括如下三部分:1.初级反应阶段。还原糖的羰基与氨基之间进行加成,加成物迅速失去分子水转变为希夫碱。2.经环化形成相应的取代醛基胺,经重排后转成有反应活性的产物,其中最熟知的是糖基化血红蛋白和果糖胺。3.果糖胺等又经过一系列复杂的分解和化学重排反应最终形成了晚期糖基化终末产物类黑精色素。
 

  @*美拉德反应,亦称非酶棕色化反应,是广泛存在于食品工业的一种非酶褐变。是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应,经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素,故又称羰胺反应(1912年法国化学家L.C.Maillard提出)。除产生类黑精外,反应还会生成还原酮、醛和杂环化合物,这些物质是食品色泽和风味的主要来源。
 

  这里是否能解释果糖的危害很大,和葡萄糖可以被有效代谢不同,果糖可能不容易被有效平抑,如果大量摄取,虽然不会带来普通意义的高血糖,但高果糖一方面不容易被控制,二是带来的化学危害更严重。
 

  晚期糖基化终末产物一旦形成就是不可逆的,并且其具有较强的交联性和较低的溶解性。此外,晚期糖基化终末产物还具有产生和激活ROS的能力,这些特点也是其损伤血管的重要理化因素。晚期糖基化终末产物的产生和糖尿病患者血糖水平以及高血糖暴露的时间成正相关,患者血糖水平越高,暴露高血糖的时间越久,晚期糖基化终末产物的产生和堆积就越多。此外,局部微环境的氧化应激也是加速晚期糖基化终末产物形成的重要因素之一。
 

  在正常机体中,葡萄糖的糖基化反应较低。然而,在糖尿病患者体内,持续性的高血糖和局部微环境的氧化应激加速了晚期糖基化终末产物产生和堆积。血液循环中堆积的晚期糖基化终末产物可进行性损害血管内皮。国外研究者发现,胰岛素可通过清除晚期糖基化终末产物来保护内皮细胞功能,胰岛素通过IRS以及PI-3K通路提高机体产生NO的能力,从而提高机体对葡萄糖的转运和利用,减少晚期糖基化终末产物的产生和保护内皮功能。此外,胰岛素还可以提高内皮细胞清道夫受体的含量,从而加速晚期糖基化终末产物的清除。另外,蓄积在体内的晚期糖基化终末产物低密度脂蛋白(LDL)可以形成晚期糖基化终末产物-LDL共价化合物(何不叫糖化LDL),形成晚期糖基化终末产物-LDL后,LDL在体内的循环清除受阻,LDL在循环中的比例升高,致体内脂质水平明显增加,加重内皮氧化损伤。此外,血管内皮的基质成分含有胶原蛋白,它们与循环中的还原性糖发生共价结合以后可以使胶原蛋白交联,从而使血管内皮内环境受到破坏。同时,血管内皮的晚期糖基化终末产物还能够激活单核巨噬系统,使得它们在对晚期糖基化终末产物发生吞噬作用的同时分泌大量的细胞因子,刺激血管内皮发生氧化,应激,变形,增生,增殖,凋亡等一系列病理反应,恶化内皮功能,最终导致动脉粥样硬化,甚至血管完全闭塞。在糖尿病患者当中,持续升高的血糖状态极易导致晚期糖基化终末产物的过量产生。研究发现,晚期糖基化终末产物可以加快血管内皮细胞的凋亡和内皮功能不全的病理进程;在晚期糖基化终末产物诱导的细胞当中,其细胞间活性氧(ROS)水平较对照组是明显升高的,而且同时,这种升高的细胞间ROS水平反过来进一步刺激晚期糖基化终末产物的不断生成,形成“氧化应激-晚期糖基化终末产物”的恶性循环。因此,如何清除晚期糖基化终末产物或减少这些晚期糖基化终末产物的产生似乎可以成为减少糖尿病并发症的改善策略之一。但是,晚期糖基化终末产物一旦在血管内皮生成共价键,其就如一团黏着的基团,很难清除。那么,如果能够拮抗由晚期糖基化终末产物介导的血管内皮功能损伤,则理论上也能预防或者延缓血管内皮损伤-动脉粥样硬化的进程。所以,探寻一种拮抗晚期糖基化终末产物介导的内皮细胞氧化应激以及凋亡的改善策略有望成为防治糖尿病并发症的潜在切入点。
 

  传统的抗氧化应激的制剂包括维生素C,维生素E,β胡萝卜素,超氧化物歧化酶等。由于结构和效价关系的限制,这些天然抗氧化剂的抗氧化作用较弱且作用可逆,组织穿透能力差,而且其循证学研究的结果多为阴性。另外,在已经发生氧化应激反应的细胞当中多半有代谢和功能障碍,其自身合成分泌抗氧剂的能力差。为此,寻求一种新型的,有效的,安全的,穿透力强,靶向性高的抗氧剂是拮抗机体氧化应激反应延缓动脉粥样硬化的潜在突破口之一。
 

  氢气是一种无色,无味,无臭具有一定还原性的易燃气体。过去许多学者认为氢气是一种生理性惰性气体,不会与机体生命物质发生生理生化反应。但也有极少数的科学家认为氢气是一种具有还原性的气体。发表在1975年《Science》杂志上的一篇文章报道,在皮肤鳞状细胞癌动物模型中,连续呼吸8个大气压97.5%氢气两周,可以有效改善鳞状细胞癌,并且研究者认为其机制可能与氢气的抗氧化作用有关。之后又有实验研究发现,呼吸高压氢气能够改善肝脏寄生虫感染引起的肝炎,并提出氢气的抗炎作用机制可能与氢气和羟自由基反应有关。虽然上述研究为引起学者的广泛关注,但Ohsawa等2007年发表在《Nature》上的一篇文章提出,缺血再灌注和炎症所致的急性氧化应激可以导致严重的组织损伤。研究者通过建立大脑缺血再灌注的氧化应激大鼠模型,在非高压的条件下,应用吸入氢气作为改善干预,结果发现氢气能够通过抗氧化作用减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。文中还讨论到,氢气可能具有选择性的抗氧化作用,也即氢气只于与·OH和ONOO-发生反应,而并不与其它具有生理活性作用的活性氧发生生物化学反应,如O2-·、H2O2和NO·等。氢气的这种温和还原性的优点,使得它在抗氧化作用的同时对机体内部必须的生理反应过程影响极小。另外,和生理活性氧O2-·、H2O2和NO·相比,·OH和ONOO-等氧自由基的氧化性明显高于生理活性氧,而这也使得还原性比较温和的氢气只与这些强自由基的发生中和反应。除了这些特点外,氢气的高物理扩散性又是其独特的优势。
 

  日本科学家Hayashida等在Ohsawa等研究的基础上,在大鼠心肌梗死缺血再灌注模型中证实吸入氢气能够有助于心梗再灌注后心功能的恢复,减少心肌梗死面积,并预防心室结构重构。实验再次证实了氢气到达改善靶点的高效性和高通透性。2010年,陈等学者在大鼠局灶脑缺血过程中,吸入氢气2小时能够降低基质金属蛋白-9活性并减小脑缺血面积。2012年,中国学者葛等在大鼠动物模型中发现吸入氢气可以减轻短暂脑缺血诱导的认知功能障碍,其可能的机制为氢气可以拮抗氧化应激作用从而减少神经细胞的死亡。同年,占等等在Crit Care Med杂志发表关于吸入氢气改善的实验研究成果。他们在130余只硬膜下出血脑损伤的大鼠模型中发现吸入氢气2小时可以明显减轻脑水肿和血脑屏障损伤。同时在分子研究层面证实,氢气可以减轻大脑脂质,核酸,蛋白质的氧化损伤。正如德国学者Hardeland对该研究的评论,吸入氢气可能是将来医学领域一种颇有前景的改善策略。不仅如此,除了吸入氢气,科学家们还利用氢气扩散特点制备成富含氢的溶液并探究其改善作用。最开始是由孙强等学者提出假设富含氢的生理盐水是否依然具有抗氧化应激作用。他们在大鼠的心梗模型中通过注射富氢生理盐水的方法对心梗后的大鼠进行干预,结果发现富氢生理盐水仍然具有有效抗氧化应激,减少心肌死亡,改善心功能的改善作用。同期还有中国学者们发现富氢生理盐水对小肠的缺血再灌注损伤也有保护作用,并同时可以改善小肠的收缩功能。另外陈涵等在大鼠实验中发现,富氢生理盐水在急性胰腺损伤中能减轻氧化应激,减少胰腺细胞死亡,有意思的是,富氢生理盐水还能促进胰腺腺泡细胞的增生。因富氢生理盐水的制备过程并不复杂,而且有使用方便,便于运输,实用等特点,一时间将富氢生理盐水作为改善制剂研究其改善作用的研究迅速成为热点,相应的研究结果均提示富氢溶液作为医疗制剂的诱人前景。尽管如此,人们对氢的抗氧化作用的具体分子生物学机制还未能深入研究。
 

  晚期糖基化终末产物可以诱导血管内皮的氧化应激反应,从而刺激内皮细胞增生,炎症细胞侵润,凋亡,内皮功能障碍,血管粥样硬化的系列病理改变。氢能否通过抑制晚期糖基化终末产物诱导的氧化应激,产生内皮保护作用有待实验进一步证实。基于此,我们课题组设计了“氢气抗晚期糖基化终末产物诱导的内皮凋亡及其机制”这课题,对我们的课题假设进行初步证实。
 

  SD大鼠购自于第三军医大学动物室,用于主动脉内皮细胞的原代培养。富含氢气的培养基被应用于模拟高氢气的环境。Real-time PCR和分光光度测定KIT用于抗氧化应激酶SOD和GSH-PH基因和蛋白表达量检测, DCF-DA作为荧光探针运用流式细胞仪检测细胞内的活性氧(ROS)水平;Annexin V-APC凋亡检测试剂盒和TUNEL染色法被用于内皮细胞凋亡的检测,蛋白印迹分析(WB)用于检测Bcl-2(凋亡抑制蛋白)和Bax(凋亡促进蛋白)比率分析于说明内皮细胞凋亡水平。
 

  研究结果

  1.晚期糖基化终末产物可以诱导内皮细胞凋亡并且呈浓度依赖性,HRM组和正常对照组的细胞凋亡水平无显著差异。晚期糖基化终末产物组细胞凋亡水平明显高于正常对照组和HRM组,加入HRM能够明显抑制晚期糖基化终末产物所诱导的细胞凋亡。

  2.流式细胞仪分析法检测发现,加有晚期糖基化终末产物的内皮细胞其细胞间ROS水平较正常对照组明显升高,且升高的水平成浓度依赖关系。但HRM组细胞ROS水平和正常对照组比较我显著差异。在晚期糖基化终末产物+HRM组中发现细胞间ROS水平较晚期糖基化终末产物组明显降低,并和正常对照组相似。

  3.抗氧应激检测显示:在mRNA方面,晚期糖基化终末产物能显著降低SOD mRNA的表达水平,而且这中降低与晚期糖基化终末产物呈浓度相关性。而HRM干预后能够明显改善晚期糖基化终末产物对SODmRNA表达的抑制作用。另外,在酶活性比较方面,晚期糖基化终末产物对内皮细胞SOD和GSH-PX这两种抗氧化酶的酶活性均成抑制效应,而HRM干预则能改善晚期糖基化终末产物的这种不良效应。

  4.凋亡蛋白水平检测发现晚期糖基化终末产物组Bcl-2表达量较正常对照组明显下降,而Bax蛋白表达量较对照组明显增加,Bcl/Bax蛋白表达量比例在改组明显下降,提示晚期糖基化终末产物明显诱导内皮细胞凋亡。在晚期糖基化终末产物+HRM组中,Bcl/Bax蛋白表达量比例较正常对照组无明显下降,提示HRM能够拮抗由晚期糖基化终末产物诱导的细胞凋亡。

  研究结论

  1. 晚期糖基化终末产物可以诱导内皮细胞凋亡和氧化应激并且呈浓度依赖性.

  2. HRM能够拮抗由晚期糖基化终末产物诱导的细胞凋亡和氧化应激,起作用可能通过提高SOD和GSH-PH以及Bcl-2(凋亡抑制蛋白) Bax(凋亡促进蛋白)比率并降低ROS水平发挥抗氧化应激和抗凋亡作用.
 

  以上内容摘自《孙学军 氢思语》,仅限于知识科普,不代表对本公司产品的宣传。

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