细菌产氢气，提高抗肿瘤免疫功能

论文概述来自南方医科大学东莞医院等单位。作者：Yan H, Fan M, Liu H, Xiao T, Han D, Che R, Zhang W, Zhou X, Wang J, Zhang C, Yang X, Zhang J, Li Z.

 

通过细菌产生氢气，解决氢气难以在体内持续停留的困难，一直有学者进行这方面探索。 2009 年哈佛大学学者补充产氢气细菌预防肝脏炎症，后来更多学者利用正常肠道内产氢气菌，给小肠不消化碳水化合物，激活肠道内细菌产氢气的潜力。发现对某些疾病具有治疗作用。我们课题组也进行类似研究，利用乳果糖增加肠道细菌产氢气，预防脑缺血作用。日本学者有利用难消化淀粉饲料，实现预防代谢综合征的作用。最近有学者通过给动物补充光合作用产氢气菌，结合光照增加细菌产氢气，发现这种细菌产生的氢气能提高动物抗肿瘤免疫功能，这一策略为氢气预防癌症增加了新手段，也在氢气抗肿瘤作用方面增加了新证据。

 

作为自然界中最轻的气体，氢气的生物效应引起了广泛的关注。早在1975年，Dole等人就发现氢气可以抑制鳞状细胞癌小鼠的肿瘤生长。氢气具有生物还原特性，被发现在某些氧化应激和炎症疾病中具有良好的治疗作用。肿瘤细胞中ROS处于高度平衡状态。氢气可以与ROS中的·OH等剧毒自由基发生反应，破坏癌细胞中ROS的稳态平衡，引起氧化还原应激。此外，与化学药物不同，氢气是安全无毒的。因此，近年来氢疗法受到越来越多的关注。He等合成了一系列金属钯化合物，用于存储和生产用于肿瘤氢气治疗的氢。此外，利用肿瘤酸性微环境如Mg、Fe纳米颗粒作为还原剂来制氢的其他策略也被制备出来。然而，这些策略受到非生物相容性材料的限制，难以实现氢气的长期释放。因此，制定新的长期制氢策略是提高氢治疗效果的关键。

 

近年来，利用细菌等微生物作为活载体和治疗疾病的药物受到了广泛关注。例如鼠伤寒S. typhimurium和梭状芽胞杆菌已广泛应用于肿瘤治疗。然而，上述细菌通常是有毒的，需要复杂的排毒程序。此外，应利用转基因技术构建释放工程菌的抗肿瘤药物。PSB是一种兼性厌氧细菌，可在光照和缺氧环境中繁殖。我们之前的工作是利用无毒的PSB作为低氧靶向光热剂用于肿瘤治疗[34]。更有趣的是，我们发现PSB在光合作用过程中会释放出氢气作为产物。在光照射下，PSB的叶绿素和类胡萝卜素捕获光子并传递到光合系统。氢是由氢化酶和氮化酶[37]共同作用产生的。此外，我们之前的工作已经证明PSB作为一种天然细菌可以增加CD4+和CD8+ T淋巴细胞的浸润，从而刺激免疫反应[34]。因此，我们认为PSB具有良好的缺氧能力和光趋化性，是肿瘤缺氧情况下原位和长期产氢的良好“储氢容器”。

 

受此启发，本研究开发出具有长期释氢能力的PSB用于癌症治疗。PSB自主定位于缺氧区，在氙灯照射下连续释放氢气。氢气扩散到细胞内，引起氧化应激，杀死肿瘤细胞。凋亡细胞释放抗原激活树突状细胞(dc)，刺激免疫反应。更有趣的是，由于化疗总是诱导PD-L1上调，诱导免疫逃逸，我们发现基于psb的治疗并没有诱导PD-L1表达增加，从而增强肿瘤的免疫治疗(图1)。因此，氢治疗与自激活免疫治疗相结合为癌症治疗提供了一种新的策略。

 

在体氢治疗疗效评价

 

对小鼠进行荧光成像以评估PSB的生物安全性。PSB用RhB标记后注射给小鼠。可见PSB主要分布在肿瘤部位保留，未向其他器官扩散。此外还验证了PSB的体内代谢。结果表明:第7天未观察到PSB的荧光。通过血液生化和血常规检测，证实PSB无毒。监测小鼠30天体重也表明其生物安全性。在证明其安全性后，研究氢气在体内的治疗效果。建立MCF-7荷瘤小鼠模型(图4A)。荷瘤小鼠随机分为PBS、PBS + L、PSB、PSB + L组。每7 d注射一次，2 d光照一次，持续21 d。记录肿瘤图像(图4B)及其权重(图4C)。21 d内小鼠体重稳定增长。每2天记录肿瘤体积。如图4D所示，PSB + L组能明显抑制肿瘤生长。与PBS组比较，PSB组肿瘤体积略有减小。这可能是因为PSB会刺激免疫反应，从而抑制肿瘤生长。21 d后处死小鼠，取肿瘤组织及主要脏器进行H&E染色等组织学分析。如图4E所示，PSB组肿瘤细胞轻度受损。PSB + L组肿瘤细胞坏死较多，其余两组肿瘤细胞损伤较小。对主要脏器进行H&E染色，发现四组处理均未对主要脏器造成损伤。TUNEL结果也显示PSB + L引起更严重的癌细胞凋亡(图4F)。我们的研究结果表明，氢气疗法对抑制癌细胞生长有良好的治疗效果。通过测量肿瘤组织中Caspase-3和细胞色素C (Cytochrome C, Cytc)的含量，发现PSB + L组的损伤含量明显高于PBS组。结果与前期实验结论一致，提示氢治疗可通过上调Caspase-3等凋亡蛋白引起细胞凋亡。

 

我们成功地将PSB作为一种微生物制氢剂用于肿瘤靶向制氢和免疫治疗。PSB在可见光下可以通过光合作用持续释放氢气。结果表明，氢气在体内外均有较好的治疗效果。有趣的是，由于PSB的存在，PD-L1的水平不会上调，这有助于增加免疫治疗，减少免疫逃逸。因此，氢疗法与自激活免疫疗法的结合为癌症治疗提供了一种新的策略。