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氢气在神经损伤保护中的研究

原文来自:中华全科医学 2017 年10月第15卷第1O期

作者单位1.蚌埠医学院2014级康复医学与理疗学专业在读研究生;2.云南圣约翰医院骨科;3.第二军医大学第三附属医院骨科

摘要:氢气以往被视为惰性气体,只应用于潜水医学,并未受到其他医学学科重视。自从2007年,日本学者发现氢气可以有效地清除自由基,改善大脑的缺血再灌注损伤,自此改变了人们的认知。此后,各国科学家积极开展各种实验以研究氢气的效应。目前,氢气被证实的效应有抗氧化、抗炎、抗凋亡等,有数十种疾病模型和人类疾病用氢气改善有效。神经损伤是一种既有药物较难治愈且起效缓慢的疾病,其损伤机制包括过氧化损伤和炎症反应等,目前临床并没有有效的解决办法。越来越多的实验人员将目光转移到氢气生物学效应研究,建立了各类中枢神经损伤或者外周神经损伤模型,用于探讨氢气对神经损伤的保护作用及机制研究。目前,氢气或氢水改善已应用于多种神经损伤模型,并被证实有保护效应,其中包括大脑的外伤性脑损伤、缺血缺氧损伤、出血后损伤和脊髓的打击伤、钳夹伤、缺血再灌注损伤、外周神经缺损损伤、视神经损伤以及自身免疫性脑脊髓炎等。本文就氢气在神经损伤保护中的研究进展作一综述。

氢是自然界最基本的化学元素,是地球上重要的物质组成部分。氢气曾一直被视为惰性气体,近年来却被广泛应用于多种实验中。。氢气分子呈电中性,体积又非常小,因此能轻易穿过细胞膜,具有极强的扩散性,能到达身体几乎任何部位。1975年,Dole M等首先在《Science>)上发表了关于氢气改善疾病的文章,该文探讨了高压氢气作为一种改善手段改善皮肤鳞状细胞癌的可能性。然而由于该试验操作设备要求高,技术难度大,并未引起人们的关注。2007年,日本科学家证明吸入2%的氢气可以改善大脑的缺血再灌注损伤,原因是氢气可以有效清除自由基,该研究成果发表在《Nature Medicine》上,引起了广大学者的关注与研究热情。目前研究表明,有数十种疾病模型和人类疾病用氢气改善有效。同时,越来越多的实验研究认为氢气或氢水可以有效防治多种神经损伤。氢水是把氢气溶解于纯净水或者生理盐水中以方便应用,是氢气的一种存在状态。以下就氢气在神经损伤保护中的研究进展作一综述。

1氢气对中枢神经损伤的保护作用

1.1外伤性脑损伤(TBI)当今社会,导致青年人功能障碍或者死亡的一个重要原因就是TBI。发生脑外伤后,患者的学习及记忆能力通常有下降表现。TBI是全世界死亡和残疾的主要原因,可能导致永久的神经功能障碍,这给家庭和社会造成沉重的负担。氧化应激和免疫炎症反应是损伤的主要病理机制。JiX等通过建立大鼠创伤性脑损伤模型,并于损伤5min后腹腔注射不同剂量的富氢水,与对照组比较发现氢水可以有效降低血脑屏障渗透性,减轻大脑水肿,减少损伤面积,可以显著提高因TBI导致的神经功能障碍,并认为这些效应可能与大脑组织中8异前列腺素F2a、丙二醛(MDA)的减少以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性升高有关。因此,氢气可能具有抗氧化作用。

除此之外,氢水还证明对脑弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)有效。DAI也属于创伤性脑损伤,但与TBI不同的是,它是以广泛轴索损伤为主要病理变化,表现为轴索肿胀、断裂、轴索回缩球形成,它的病理机制目前仍不清楚。研究人员采用头颅瞬间旋转损伤装置制作大鼠DAI模型,实验组予以腹腔注射高浓度氢气(10ml/kg),连续3d,每天2次,结果发现氢气注射组较对照组相比大脑皮层星形胶质细胞有所减少,白细胞介素-6(IL-6)、IL-1p及相关信号通路p-JNK表达降低,说明氢气具有减轻炎性反应的作用。

1.2大脑缺血缺氧性损伤脑缺血是临床上一种十分常见的疾病,病理生理机制复杂。一般表现为缺血再灌注损伤,而羟自由基(hydroxylfreeradical,·OH)和亚硝酸阴离子(peroxynitriteanion,ONO0-)等自由基又是损伤的主要因素。OhsawaI等学者最早对氢气对神经系统的影响进行研究,其通过对培养的神经元实施氧糖剥夺60min模仿缺血再灌注过程,24h后观察,发现在氢气环境下的神经元存活率和活性更高,·OH水平有所下降,并通过阻断大脑中动脉90min,再灌注30min建立大脑缺血再灌注模型,然后吸人不同浓度的氢气,结果发现动物吸人2%的氢气后,·OH和ONOO-含量下降,大脑的梗死面积明显变小,氢气显著改善了脑缺血再灌注损伤状态,得出结论氢气可以减轻氧化应激反应,抑制脑损伤。

吸入高浓度氢气是近年来氢气改善的新方式,并且也取得了确切疗效。袁楠楠等¨刮采用四血管阻断法建立全脑缺血再灌注(Ischemia.reperfusion,I/R)损伤模型,研究高浓度氢气吸入对大鼠全脑L/R损伤海马CA1区神经元的影响。分别于术后72h、9d观察,发现氢气干预组海马CA1区神经元存活数量明显较多,形态接近正常;小胶质细胞数量明显减少,大鼠的学习记忆和空间定位能力提高,提出其机制可能与氢气抑制I/R后小胶质细胞的激活与活化有关。全脑I/R可诱导炎性细胞因子的激活,并影响全身免疫系统导致损伤加重,调节性T细胞(Treg细胞)与MicroRNA(miRNA)参与了细胞反应过程。LiQ等在制造大鼠全脑I/R模型后即刻与6h,分别向大鼠腹腔注射氢水,于术后6、24和96h观察,发现对照组海马的miR.210表达显著增加,氢水可抑制其表达;Treg细胞数目在I/R组下降,而氢水处理使之增加;并且发现24h的Treg转化生长因子-B(transforming growth factorTGF)、TNF-a和NF=KB含量存在高度相关,因此,大鼠的脑复苏机制可能与上调的Treg细胞数有关。

1.3大脑出血后损伤蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种具有高病死率、高致残率和不良预后的毁灭性脑血管疾病。早期脑损伤(early braininjury,EBI),即在SAH后72h内发生的损伤,是SAH不良预后的原因。在EBI中起关键作用的是氧化应激,主要由氧合血红蛋白刺激产生。另一个参与EBI病理生理过程的重要因素是炎症。一些文章证明,氢气诱导的保护效应与NFKB通路有关,这种信号通路会导致脑水肿、炎症、神经元凋亡和血脑屏障破坏,NFKB在SAH后被激活。因此,终止激活NFKB的易位过程可以阻断许多与炎症相关的基因转录,并且最终减轻SAH相关的EBI。Shao A等探讨了在SAH后早期通过腹膜内注射氢水对NFKB途径和NLRP3炎症小体的影响,采用血管内穿孔法制作SAH模型,随机分为假手术组,SAH组,SAH+生理盐水组和SAH+氢水组。所有大鼠在SAH后24h处死,经过检查发现氢水改善可以通过抑制NFKB活化和SAH后NLRP3炎症小体形成,来减弱炎症反应。Hong Y等进一步探讨了氢气在SAH中抗凋亡的分子机制,于即刻和8h分别给予大鼠腹腔注射富氢水,并于术后24h检测Akt、pAkt、GSK3B、pGSK3b、Bcl-2、Bax和caspase 3等,通过对照发现,氢水可以减轻EBI中神经细胞凋亡,可能是通过AKT/GSK3B通路发生作用。

脑内出血(intracerebralhemorrhage,ICH)后的肥大细胞的活化会增加血脑屏障(blood—brain barrier,BBB)渗透性,形成脑水肿,因而造成大脑损伤。Manaenko A等利用ICH模型通过观察氢气对肥大细胞的影响来验证氢气对神经的保护作用。8周龄的雄性小鼠,分别制作胶原酶诱导模型和自体血液注射模型,然后吸入含2.9%氢气和2l%氧气的混合气体,结果显示:在ICH后24和72h,血脑屏障被破坏,出现脑水肿和神经缺陷,同时Lyn激酶的磷酸化和类胰蛋白酶释放,证明了肥大细胞的活化,氢气吸入减少了此反应,因此认为氢气吸人通过防止肥大细胞活化,阻止了血脑屏障的破坏。

1.4实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)多发性硬化是一种迟发性变态反应性疾病,发生在中枢神经系统,属于自身免疫性疾病,具有慢性、反复发作性、中枢神经系统脱髓鞘性等特点,由髓鞘蛋白抗原主动免疫实验动物诱发,EAE是其动物实验模型。谢建平等使用大鼠制作EAE模型,每日腹腔注射不同剂量的富氢盐水,连续20d,记录大鼠体重、行为学评分变化;干预结束后进行脊髓白介素.17(IL-17)、.干扰素(INF-y)以及SOD活性检测。结果发现氢水干预明显降低了疾病发病率,抑制发病后体重下降,并且减少了炎症因子释放,并且6ml/kg剂量比3ml/kg效果更佳。

1.5脊髓外伤脊髓受到外来暴力打击后,会产生一系列病理生理变化,其造成的损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤的具体机制尚不明确,目前公认的因素有氧自由基介导的脂质过氧化反应、兴奋性氨基酸、钙离子超载、前列腺素等。因此,减少ROS的产生就能够减轻脊髓继发损伤的损伤程度,从而为神经功能恢复创造有利条件。

中枢神经损伤后,星形胶质细胞增生肥大,特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达随之增加。增生的星形胶质细胞聚集于损伤处形成瘢痕,形成了一道机械屏障和化学性屏障,不利于神经再生。氢水被证明可以抗炎及抑制星形胶质细胞活性。Liu FT等建立大鼠Allen脊髓打击模型,每12h进行一次氢水腹腔注射,结果发现氢水对照组在术后1dSTAT3、p-STAT3、GFAP和促炎性细胞因子就有所下降。在术后7和14d观察到星形胶质细胞活性被抑制,大鼠运动功能有所提高,尤其是注射氢水减少了星形胶质细胞内活性氧含量,减少了促炎性细胞因子的产生以及星形胶质细胞的聚集。蛛网膜下腔注射氢水可以抑制细胞凋亡,减轻脊髓损伤。孙建锋通过对大鼠脊髓损伤模型进行局部蛛网膜下腔间断注射富氢盐水(0.25ml/kg),证明富氢盐水能上调SOD水平,减轻氧化应激损伤,抑制炎症反应,并使降钙素基因相关肽(CGRP)表达水平上调。CGRP是一种保护神经细胞的调节肽,通过上调保护神经细胞功能,进而抑制细胞凋亡。脊髓钳夹损伤模型用来模拟挤压应力对脊髓造成的损伤。顾峥嵘等研究了高浓度氢气吸入对小鼠脊髓钳夹损伤的影响,对改善组给予66.7%氢气吸入,持续3d、每天4次的方案改善。结果表明氢气改善组小鼠脊髓钳夹伤后的BMS评分、BBB评分均升高、caspase 3蛋白的表达水平降低,小鼠足迹分析结果和脊髓损伤区的组织形态均得到明显改善。

1.6脊髓缺血再灌注损伤I/R损伤属于脊髓的继发性损害,是造成神经损伤的重要因素之一。实验证明吸人氢气或注射氢水均可减轻脊髓I/R损伤。Zhou L等对新西兰大白兔进行20min肾下主动脉夹闭,建立脊髓I/R模型,分别在夹闭前后5min进行氢水(5mL/kg或10ml/kg)静脉注射,结果较对照组相比,氢水注射提高了损伤后脊髓中SOD和CAT活性,减少了前角运动神经元死亡和TNF及HMGB1的产生,降低caspase3活性,明显提高了后肢功能评分,并提出激活mitoKATP通道可能是氢水改善脊髓损伤的保护机制,预防性注射氢水对于脊髓损伤同样有效。孙延卿等通过ZIVIN法制备脊髓I/R兔模型,并采用氢盐水改善,于再灌注后6、12、24、72h与模型组相比,发现氢盐水组兔后肢运动功能评分明显较高,72h时脊髓MDA浓度降低、SOD浓度升高,前角运动神经元凋亡及炎性细胞浸润减少,认为其作用与其抗氧化有关。腹腔注射氢水还可以增加血管内皮生长因子(VEGF)的表达VEGF是一种多肽类糖蛋白,能够特异性的促进血管内皮生长和血管形成,因此能改善脊髓的微循环障碍,从而发挥保护神经作用l。研究人员采取开腹并夹闭腹主动脉35min的方法建立兔脊髓缺血再灌注模型,于术前5min及8h通过腹腔注射富氢盐水(5ml/),发现氢水注射可以减少炎性细胞浸润及细胞凋亡,减轻神经纤维的排列紊乱,与生理盐水对照组相比,降低了MDA含量,升高了CAT活性,缓解了红素氧合酶1(HO-1)的下降,髓过氧化物酶(MPO)、细胞间黏附分子-1(CAM1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量显著下降,而血管内皮生长因子VEGF的表达则明显增加。

2氢气对外周神经的保护作用

2.1外周神经再生外周神经损伤在临床中极为常见,尽管轴突有自发再生能力,但没有手术干预,轴突再生进入残端弥补缺损、恢复功能仍然比较困难。自体神经移植目前是最常见的修复策略,组织工程神经移植(TENGs)也已被批准用于临床的外周神经修复。然而,他们的效果通常不太令人满意。药物疗法是外周神经损伤的重要辅助改善,许多药物通过抗氧化或抗凋亡机制发挥神经保护作用;因此,具有抗氧化和抗凋亡的物质在外周神经损伤后具有改善应用的潜力,氢气的应用也开始报道。ZhangYG等使用60只雌性SD大鼠,采用臀肌分离切口暴露右坐骨神经切除坐骨神经的10mm节段并在手术显微镜下反转后与神经切口连接。缝合伤口后对实验组大鼠每天腹膜内注射5ml/kg氢生理盐水。通过进行行为分析、电生理评价、Fluoro.Gold(FG)逆行跟踪和再生神经和腓肠肌肌肉的组织形态学观察,评估轴突再生和功能恢复情况。结果表明通过富氢水减轻了外周神经损伤,对神经再生改善有效果。

2.2视神经损伤(ONC)氢水可以保护视网膜神经节细胞(RGC)。视神经(目前有学者认为视神经属于中枢神经系统)损害由视神经传导通路上某种病因引起,表现为传导功能的异常。Sun JC等通过手术建立ONC模型,并于早上6点和晚上6点对大鼠进行腹腔注射氢水(5ml/kg),发现氢水可以降低RGC凋亡,降低MDA水平,而且可以提高闪烁诱发电位和瞳孔对光反射反应。证明氢水对视神经损伤有保护作用。

通过研究我们发现,氢气可对各类神经损伤有效,如果能将氢气进一步应用于临床或许能改善当前现状,使之成为神经损伤的一种辅助改善措施或是康复手段。

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