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分子氢与健康 神奇的氢聊
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氢疗在日本的研究进展

氢分子是自然界中最小的分子,且分布广泛。在过去,生物学家们一直认为氢分子是一种生理性惰性气体,不能与机体内的物质发生反应,仅用于潜水医学领域。然而,在2007年7月,日本的研究者Ohsawa等在《自然·医学》杂志上报道称,让脑缺血的大鼠吸入浓度为2%的氢气可以明显降低脑梗死的面积大小,并能够显著改善缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤和降低中风的风险。这一研究首次证明了小剂量氢气的改善作用,并迅速引起了国内外学者的高度重视。随后,越来越多的研究在各种疾病模型中相继证明了氢分子的改善作用,包括缺血再灌注损伤、神经退行性变、代谢综合征、炎症性疾病等。由此可见,氢气不仅不是生理性惰性气体,而且还是一种理想的改善性医疗气体。
 

氢疗在日本的研究进展
 

氧化应激是大多数疾病共同的病理基础,在以往的抗氧化实验研究中,生物学家们常常利用强还原剂如维生素A、维生素C、维生素E、B胡萝卜素和硒等,来对抗过量的氧化剂或有毒性的活性氧,但研究并未证明上述抗氧化剂能有效改善氧化应激所造成的疾病。究其原因,一方面是这些强还原剂没有选择性抗氧化作用,可能会将具有重要信号作用的活性氧清除,与自由基反应还会产生对人体不利的代谢产物,从而导致体内氧化还原状态失衡;另一方面是这些还原剂可能根本无法到达细胞中负责生产活性氧的线粒体附近。而氢分子作为一种高效的自由基清除剂,其在抗氧化方面呈现出十分明显的优势。首先,氢分子可以选择性地降低最具细胞毒性的活性氧(ROS)——羟基自由基(·OH)和过氧亚硝酸盐(ONOO)的水平,并且不干扰代谢氧化还原反应以及参与细胞信号传递的自由基如过氧化氢等;其次,氢分子是电中性的,远远比氧分子小,相对于其他水溶性抗氧化剂来说,它能够更容易地穿过血脑屏障,渗透生物膜、细胞溶胶、线粒体,甚至在一定条件下能够转移到细胞核,从而起到保护细胞的作用。再者,氢分子本身结构简单,与自由基反应也不会产生对人体不利的代谢产物,例如与羟自由基反应生成水,多余的氢可通过呼吸排出体外,不会有任何残留。以上特性,决定了氢分子在生物医学领域拥有良好的研究前景,也由此开启了全新的研究领域—氢分子医学。
 

下面结合笔者课题组的研究情况,为大家介绍一下日本在氢分子医学方面的研究和进展。
 

氢分子最佳的给药方式、途径以及体内药代动力学
 

目前外源性氢分子的利用主要是通过吸入低浓度氢气、饮用富氢水(HSRW)、腹腔或静脉注射富氢生理盐水(HSRS)以及局部应用等多种途径来实现的,然而氢分子的体内动力学、药代动力学尚未明确,最佳的给药方式还有待进一步斟酌。外源性氢分子通过不同途径进入机体,在体内有怎样的代谢过程以及靶器官组织中的氢分子浓度会有怎样的变化等,这些问题的解决都对氢分子医学的发展至关重要。
 

笔者课题组首次采用高精度传感器气相色谱法精确测定了摄入外源性氢分子后,Wistar大鼠血液和各器官组织中氢分子的浓度。通过口服HSRW、腹腔及静脉注射HSRS以及吸入氢气等方式让大鼠摄入外源性氢分子,然后测定大鼠各器官组织中的氢分子浓度。我们发现,血液和器官组织中的氢分子浓度主要取决于HSRW/HSRS的给药剂量、氢气吸入量以及摄入氢分子后的时间。
 

氢浓度在口服和腹腔注射后5分钟、静脉注射后1分钟达到峰值。吸入氢气后,在30分钟时氢浓度明显升高,此后保持不变。准确测定使用不同给药途径情况下大鼠血液和各器官组织中的氢分子浓度,对于利用氢分子进行各种新颖的医学改善方法的应用具有重要意义,有助于氢分子在众多临床实践中的应用,并为临床医生选择合适的给氢途径以及开发新的临床改善方法提供参考。
 

氢分子对疾病的预防和改善作用
 

(1)缺血再灌注损伤与器官移植:大量的研究表明,氢分子具有抗氧化和抗细胞凋亡的作用,能够通过清除羟基自由基(·OH)和讨氢亚硝酸盐根(ONOOˉ)来减轻缺血再灌注引起的氧化损伤,在心、肝脏、肾、脑、肺、小肠等器官的缺血再灌注模型上,都证实了氢分子的作用,即可以通过减少缺血再灌注损伤而不改变血流动力学参数来减少器官的梗死体积以及保护由全身炎症引起的多器官损伤等。
 

另外,氢分子还能减轻移植供体在体外的氧化损伤。2012年,笔者课题组在研究中发现,在同种肾移植大鼠模型中,富氢UW溶液(Hydrogen-Rich University of Wisconsin Solution,HRUW)可以在早期阶段,通过降低肾脏移植物的氧化应激、肾小管上皮细胞凋亡和间质巨噬细胞浸润发挥保护肾小管上皮细胞免受炎症和凋亡影响的作用,从而减轻肾移植缺血再灌注损伤、改善肾脏功能并延长受体存活率。
 

2014年,日本庆应义塾大学的Hayashida等指出在冠状动脉血流重建之前吸入2%氢气可以快速增加“心肌梗死高危区域”的氢气浓度,并在冠状动脉再通时减轻缺血/再灌注损伤。大多数抗氧化剂在再灌注开始前并不能及时到达梗死危险区域,然而吸入氢气不仅起效快,还能在不影响血压的情况下对抗急性氧化应激,即使在没有血流的情况下,氢气也可以通过快速扩散到达危险区域。Kentaro等的研究使用了已建立的心脏异位移植模型,先将供体大鼠的心脏移植物储存在包含Celsior且氢气可渗透的塑料袋中,浸入含有高浓度氢气的保存液的电解槽中6小时,然后将心脏移植物进行异位移植。在无氢处理的对照组移植物中,再灌注3小时后血清肌钙蛋白 I 和肌酸磷酸激酶均显著升高,移植物表现出明显的炎症反应,包括中性粒细胞浸润、促炎细胞因子、趋化因子以及信使RNA的上调。而富氢水浴则可显著减轻心肌损伤和炎症反应。相比对照组,富氢水浴组的心脏移植物线粒体损伤明显减少,三磷酸腺苷含量也明显增高。
 

小肠移植(SBT)是终末期肠衰竭的唯一改善方法,但是由于免疫抑制和缺血再灌注(I/R)损伤,患者和移植物的存活率很低。2014年,笔者课题组研究发现,肠移植前肠腔内注射含氢保存液可以有效改善大鼠肠移植缺血再灌注损伤。实验分为四个组:假手术组、无肠腔注射组、肠腔注射5%葡萄糖盐水(GS)组和肠腔注射富氢5%葡萄糖盐水(HRGS)组。我们发现,HRGS组的氧化应激反应明显减少,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、TNF-a、IL-6等促炎细胞因子水平降低,隐窝细胞凋亡也明显受到抑制。在组织病理学上,HRGS组与其他组相比保持了肠绒毛的完整性。由NOS生成的一氧化氮与超氧自由基反应生成过氧亚硝酸盐,具有很强的氧化能力。在HRGS组,iNOS表达明显受抑制。因此,氢分子不仅可以减少羟基自由基,还可以减少过氧亚硝酸盐。我们的研究首次证明了腔内注射富氢溶液的有效性,也是SBT肠移植物保存方法的一个重要突破。
 

由于器官短缺,有的时候需要使用次优移植物,脂肪肝对包括肝移植在内的肝脏手术中的缺血再灌注(I/R)损伤具有较低的耐受性。笔者课题组在蛋氨酸和胆碱缺乏症(MCDHF)饮食诱导的脂肪肝小鼠模型中,研究了氢分子对I/R肝损伤的保护作用。在缺血再灌注过程中,我们用含7ppmH2的生理盐水进行处理,并分析处理后细胞凋亡相关蛋白及其信号通路的组成。与对照组相比,MCDHFI/R组血清AST、ALT、TUNEL阳性凋亡细胞、F4/80免疫阳性细胞、炎性细胞因子mRNA水平、信号通路成分、肝促凋亡分子、库普弗细胞(Kupper cells,KCs)以及原代肝细胞均明显升高。而富氢盐水改善组则显著抑制了脂肪肝模型缺血再灌注损伤的征象,并且增加了肝脏、KCs和肝细胞中Bel-2、HO-1和SIRT1的表达,抑制了caspase的活化、Bax和p53的乙酰化。由此可见,氢分子能够通过减少肝细胞凋亡、抑制巨噬细胞活化和炎症细胞因子、诱导HO-1和SIRT1表达,改善脂肪肝模型的缺血再灌注损伤。
 

之前的研究报道,HO-1是一种与热休克蛋白相关的成分,是一种限速酶,可将血红素分解为胆绿素、一氧化碳和游离铁,具有抗氧化功能、微循环维持功能、细胞周期调节功能和抗炎功能。笔者课题组在Lewis大鼠同基因原位肝移植模型中研究发现,氢分子可以通过上调HO-1的表达,改善肝脏缺血再灌注损伤。在氢改善组,我们将肝脏移植物放入一个装有70毫升冷富氢UW溶液塑料储存袋中密封,然后浸入富氢液中以保持氢分子的浓度。在富氢UW溶液中保存的移植物,其肝组织中氢分子的浓度随保存时间的延长而升高,1小时后趋于稳定,血清肝酶水平显著降低,肝损伤的组织学评分明显低于对照组。和对照组相比,富氢UW溶液组肝脏移植物的氧化损伤和肝细胞凋亡减少,促炎细胞因子表达降低,HO-1蛋白水平显著升高。
 

在医学实践中,器官摘除前的改善往往是非常困难的,而在植入前的器官靶向改善则应用广泛。我们使用的富氢UW溶液和氢气水浴作为器官保存新方法是突破性的,且具有安全、简单的特点,为药物、气体和移植的新联合疗法提供了强有力的基础,具有重要的临床意义。
 

(2)脑血管疾病:氧化应激具有破坏神经元的作用,是导致神经退行性病变的主要原因之一。因此,需要有效的抗氧化剂来保护神经前体和神经元使大脑免受氧化损伤。然而,大多数抗氧化剂由于无法通过血脑屏障而不能接触神经元,而氢分子具有抗氧化应激的作用,并且能够通过气体扩散的方式穿透血脑屏障,保护神经元,对轻度认知障碍、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病都有一定的保护作用。Kiyomi Nishimaki等研究发现,在痴呆小鼠模型中,饮用富氢水可以明显降低氧化应激标志物水平,抑制小鼠的记忆力减退和神经退行性变。此外,富氢水组的平均寿命也比对照组长。
 

2009年,九州大学的研究者Kyota Fujita等在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病小鼠模型中发现,饮用富氢水可以抑制多巴胺能神经元的丢失,减轻MPTP对多巴胺神经元的急性毒性作用,对MPTP慢性给药模型引起的行动障碍也有一定的作用。
 

2012年,日本顺天堂大学的Asako Yoritaka等对17例使用左旋多巴药物改善的帕金森病患者进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的临床研究,评估了富氢水对左旋多巴胺化帕金森病患者的疗效。在48周的时间里,参与者每天饮用1升的富氢水或者纯水。结果显示,富氢水组患者在统一帕金森病评定量表(UPDRS)中的分数得到了明显改善,而安慰剂组的UPDRS分数则变得更差。尽管存在样本数量以及实验时间等限制性因素,但是两组结果的显著差异在一定程度上说明富氢水对帕金森病起到一定的改善作用。
 

氢分子改善在脑血管疾病方面也显示出巨大的潜力。缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是指围生期缺氧缺血窒息引起的脑损伤,已被证实是新生儿死亡和残疾的主要原因。笔者课题组研究发现,在新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤模型中,吸入氢气能够显著减轻新生HIBD大鼠的神经元损伤,有效改善早期神经反射以及大鼠成年后的学习记忆。这种保护作用与持续吸入氢气的起始时间和持续时间有关。此外,吸入氢气还可以通过激活MAPKs信号通路来增加HO-1的表达,上调PGC-1a和SIRT1的表达来增强细胞抗氧化防御能力。
 

笔者课题组还评估了氢气吸入不同时长对HIBD改善的神经保护作用。首先,我们诱导了出生后第7天的大鼠缺氧缺血脑损伤模型,然后分别让其吸入氢改善30分钟、60分钟或90分钟。通过检测脑内白细胞介素-1(IL-1)、NFcBp65表达及Iba-1免疫荧光来评价其急性炎症反应,再通过检测p-JNK、p53的表达及NeuN免疫荧光检测神经细胞凋亡。术后36天采用Morris水迷宫实验对大鼠神经行为功能进行评估。结果表明,氢气可以抑制缺氧缺血损伤诱导的小胶质细胞炎症反应。改善时间越长,这种抑制作用越明显(P<0.05)。其次,氢气改善可以减少缺氧缺血引起的神经元损伤,使凋亡因子p-JNK、p53表达降低(P~0.05),还能够改善缺氧缺血导致的脑发育过程中出现的长期空间记忆缺失(P<0.01)。
 

(3)代谢性疾病:氧化应激被普遍认为与各种代谢性疾病有关,包括肥胖症、糖尿病、衰老和脂肪肝等。氢分子已被证明可以减轻氧化应激,改善脂质、葡萄糖和能量代谢。此外,饮用富氢水会降低2型糖尿病和潜在代谢综合征等患者的几种氧化应激生物标志物水平。
 

氢分子还能够促进能量代谢。2011年,日本医科大学的Kamimura等通过研究发现饮用富氢水能够显著改善db/db小鼠脂肪肝,对野生型小鼠高脂饮食诱导的脂肪肝也有明显改善。而且长期饮用可明显控制脂肪和体重,降低血浆葡萄糖、胰岛素和甘油三酯水平,增强肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子21(FGF21)的表达。
 

2014年,冈山大学的Tomafuji等研究发现,氢分子还能够通过减少氧化性mtDNA的损伤来延缓大鼠模型牙周组织的老化。除了端粒短缩外,活性氧(ROS)也被证明可以通过pl6INK4a和p2130的转录激活,触发DNA损伤反应(DDR)通路,促进细胞衰老。
 

2018年,东京都老年医学研究所的Iketani在动脉粥样硬化的小鼠中发现,氢分子对细胞衰老抑制作用可能是因为其可以降低ROS而下调DDR通路的表达。他们使用低密度脂蛋白受体缺陷小鼠通过喂养高脂肪饮食(HFD)13周建立动脉粥样硬化模型,评估持续饮用富氢水的效果。在富氢水饮用组的小鼠动脉粥样硬化中,表达衰老因子pl6INK4a和p21的内皮细胞数量明显低于对照组小鼠。此外,巨噬细胞浸润和TNF-a表达也相对于对照组有所降低,这些结果都表明了氢分子可以抑制血管老化。
 

本课题组的研究发现,富氢水可以有效地预防胆碱补充氨基酸(CSAA)饮食诱导的脂肪肝,改善胆碱缺乏性氨基酸(CDAA)小鼠肝脏纤维化。富氢水组小鼠的炎症细胞因子mRNA表达明显低于对照组。更重要的是,富氢水可以逆转非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的肝细胞凋亡、肝炎症状以及肝脏的纤维化。在本研究中,我们发现氢分子是一种新的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)保护因子,可以通过诱导Kupffer细胞HO-1/IL-10轴来调控STAT3磷酸化从而改善NAFLD。氢分子与HO-1/IL-10轴相互作用,抑制STAT3磷酸化和下游pMAPK信号的激活。以氢分子为靶点对小鼠NAFLD具有改善作用,可能是开发新型HO-1/IL-10轴激活剂改善NAFLD/肝纤维化的有效策略。
 

CD36在正常肝组织中的表达水平很低,但在高脂饮食(HFD)诱导的脂肪肝小鼠和NAFLD患者的肝组织中表达水平显著升高,大量研究证明CD36在肝脂肪变性中起重要作用。东京都老年研究所的Akio等研究发现,氢分子能够下调CD36蛋白表达,抑制HepG2细胞的脂肪酸摄取和脂质积累,还能够调节信号转导,如JNK通路等,证明了氢分子对肝脂肪变性和NAFLD等脂代谢紊乱具有调节作用。
 

越来越多的证据表明,氢分子不仅可以降低氧化应激,还可以发挥基因表达和信号通路调节的作用。然而上述研究并未阐明氢分子在基因表达和信号转导通路上的作用靶分子。这些调控分子可能不是氢分子的直接效应分子,但是可以间接使用氢分子发挥作用。由此推测,氢分子在这些疾病中的效应很可能是通过对某些未知基因和信号通路的调节介导的,同时也需要更多的研究去加以论证。
 

(4)消化系统疾病:肠道细菌是体内氢的唯一来源,机体内大量的肠道菌群每天可以通过发酵未被吸收的碳水化合物来产生大约150mL的氢气,随后排泄出人体或者被结肠菌群吸收而进一步代谢。与其余气体性细菌产物相比,氢气能够改善肠管的运动性而抗菌改善能够显著减少肠道氢气的产生。小鼠胃和肝脏的氢分子浓度为20~80umol/L,这些氢分子被血液吸收后运送到身体各部分,发挥内源性抗氧化物质的作用。
 

虽然人类和许多动物的胃肠道本身可以产生氢气,但到目前为止,并没有证据证明它有明显的改善效果。然而研究表明,通过诱导胃肠道产生更多的氢气,可以改善一些疾病。Kajiya等研究发现,通过给动物补充可产生氢气的细菌,诱导胃肠道产生更多氢气,可以抑制Concanavalin A诱导的肝脏炎症反应。该研究者还发现,通过饮用富氢水可以获得比诱导胃肠道产生氢气更有效的改善效果。与补充外源性氢相比,内源性氢效力低并且产氢菌的腔内管理有细菌过度生长的风险。所以,目前大多数的研究主要是围绕补充外源性氢开展的。
 

已有研究表明,运用氢分子改善可以改善葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠炎症性肠病,小鼠结肠短缩、体重减轻的情况明显好转。氢分子可以抑制DSS介导的结肠组织破坏,炎症细胞对黏膜层的浸润也明显减少,但其确切机制尚未完全明确,本课题组正对其展开深入研究,为氢分子用于炎症性肠病的临床改善提供重要的理论支持。
 

氢分子医学的局限性
 

到目前为止,国际上关于氢气改善疾病的基础研究已经广泛开展,这些研究涉及器官缺血再灌注、糖尿病、脂肪肝、系统炎症和帕金森病等。然而,在实际研究中仍然存在一些问题,如细胞膜脂质和硫醇类含量比实验中的氢分子含量要大得多,氢分子是否能够与这些细胞上的羟基自由基靶分子竞争。另外,羟基自由基和氢分子反应生成水的速率常数比大部分的自由基反应都慢,氢分子的药代动力学尚未完全明了。
 

虽然已有大量的动物实验证明氢分子对多种疾病有改善作用,但缺少严格的随机对照临床试验的证据,还远不能达到官方正式批准用于临床使用的水平。
 

目前大多数临床研究为开放式研究,样本量相对较小,仅评价了给予氢分子后的效果,只有少数研究对临床特征和患者健康状况进行了评价,仍需要大规模多中心随机双盲对照临床研究证据来推动氢分子疗法的临床应用。此外,大多数研究停留在氢分子防治疾病的观察层面上,其作用本质仍然未被充分认识,分子靶点还未知。
 

已有研究表明,氢气是细胞内发挥重要作用的信号分子,其作用方式与一氧化氮、一氧化碳和硫化氢相似。作为信号转导参与者,氢气还可能调控相关蛋白质的表达或某些信号蛋白质的磷酸化。另外,目前仍存在许多疑问,比如其抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡及调节信号通路功能等之间的交叉关系是怎样的,氢分子是否是“第4种气体信号”,氢分子是否是“没有任何毒性的药物”等,这些都需要进一步的研究探索,以便为氢分子真正成为一种临床药物奠定基础。
 

氢分子医学临床应用现状和展望
 

氢分子具有制备容易、价格低廉、渗透性强、应用范围广等诸多优点,并且能够抗氧化、抗凋亡、抗炎和保护细胞等,具有很强的临床应用前景。此外,氢分子的安全性也得到了探索和证实,即使在高压、高浓度状态下对人体依然无副作用,过量积累的影响可以忽略不计。2015年,Hyspler等采用氢同位素结合体外研究,确认了氢分子是无毒性的,对机体无损害,并且可产生非常明显的抗氧化效果,这为氢分子医学研究和产品市场带来了巨大的影响。
 

2008年,日本京都府立医科大学的研究者Kajiyama等对30例饮食和运动疗法控制2型糖尿病患者和6例糖耐量受损(IGT)患者进行了随机、双盲、安慰剂对照、交叉研究。患者连续8周每天饮用900毫升富氢水或者纯水,洗脱期为12周。该研究发现,摄入富氢水显著降低了低密度脂蛋白胆固醇,尤其是变性低密度脂蛋白胆固醇净负电荷和尿8-异前列腺素的水平。富氢水的摄入也与血清氧化低密度脂蛋白和游离脂肪酸浓度下降、血浆脂联素和细胞外超氧化物歧化酶水平升高有关。在6例IGT患者中,4例摄入富氢水的患者口服葡萄糖耐量试验正常化。这些结果都表明富氢水能够阻碍并已经发现有改善疾病的效果,应该积极采用多中心大样本量双盲对照研究,以进一步扩大研究成果,争取早日确定氢分子用于临床改善的疾病类型。目前,给予临床患者的氢分子的剂量并未标准化,而且在已有的研究中氢分子剂量大小与疗效似乎也不成正比。我们应重视氢分子剂量的标准化,未来更多的研究应采用随机对照实验和现有资料的系统检索,期待能阐明包括剂量-效应曲线、对多种疾病的长期临床效应等在内的相关问题,这将有助于临床医生运用这一创新改善手段来满足各种医学需求。
 

结论
 

氢气是一种理想的医用气体,它能够在细胞水平发挥作用,可以作为对抗心脑血管、癌症、代谢和呼吸系统疾病的新型改善策略的候选。氢分子的研究从最初的起步,经过了漫长的发展,虽已取得了重要的成果,但还需要进一步的研究。为了使氢分子疗法在临床试验中有效并最终应用于医学实践,我们还需要充分地发现和探索氢分子作用的确却切机制。氢分子如何清除羟基自由基和减少炎症,如何参与细胞信号传导和激活、抑制通路以及如何与其他抗氧化剂相互作用以促进细胞保护等,这些缺失的环节都非常重要。此外,还需要确定不同疾病模型中特定浓度的效力以及最佳的给药形式。氢分子疗法看起来似乎是完美无缺的,但仍需要在未来的研究中加以探索。

希望氢分子能走在医学的最前沿,在改善神经退行性疾病、心血管疾病、器官移植以及其他许多疾病方面取得长足进展。希望我们可以不懈努力,积极开辟新的研究领域,从多角度寻找突破,加强创新,开发相关研究产品,从而更好地为人类健康服务。

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